RP- HPLC mit gebundenen Phasen
Die Reversed Phase-Chromatographie (RPC) entstand als „Umkehrchromatographie“ aus der Normalphasen-Chromatographie (NPC). Sie ist für ein breites Spektrum an Analyten einsetzbar und daher die am häufigsten angewandte Methode in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Die Trennung beruht auf Wirkweisen sowohl der Adsorptions- als auch der Verteilungschromatographie.
Als stationäre Phase dient in der RPC modifiziertes Kieselgel, an das hydrophobe Alkylketten unterschiedlicher Länge kovalent gebunden sind. Die stationäre Phase wird so apolar, eher apolare Analyten werden stärker retardiert als eher polare. Aus sterischen Gründen werden jedoch nicht alle Silanolgruppen umgesetzt, so dass das Säulenmaterial weiterhin auch einen polaren Charakter aufweist. Dies führt dazu, dass ebenfalls Wechselwirkungen zwischen den restlichen freien Silanolgruppen und polaren Gruppen der Analyten auftreten können. Um die Hydrophobizität des Säulenmaterials zu erhöhen, wurde daher optional das „endcapping“ eingeführt, d.h. das Reversed-Phase-Säulenmaterial wird in einem zweiten Schritt mit z.B. Trimethylchlorsilan umgesetzt, welches an die freien Silanolgruppen bindet.
| Phasenname | Formel | Aufbau | Anwendung | USP Nummer | Mögliche Materialien |
| Octylsilan (C8), non endcapped | -(CH2)7-CH3 |  |
Mittelpolare Verbindungen | L7 | Waters Symmetry C8 |
| Octylsilan (C8), endcapped | -(CH2)7-CH3 |  |
Mittelpolare Verbindungen | L7 | Merck Chromolith Performance RP-8 endcapped |
| Octadecylsilan (ODS, C18), endcapped | -(CH2)17-CH |  |
Apolare und mittelpolare Verbindungen | L1 | Altmann Reprosil Pur C18-AQ |
| Phenyl | -(CH2)3-C6H5 |  |
Mittelpolare Verbindungen, ungesättigte Verbindungen | L11 | Altmann Reprosil 100 Phenyl |
| Phenyl-Hexyl | -(CH2)6-C6H5 |  |
Ungesättigte Verbindungen, mittelpolare Verbindungen | L11 | Waters XTerra Phenyl |
| Pentafluorphenyl (PFP) | -(CH2)3-C6F5 |  |
Ungesättigte Verbindungen, halogenierte Verbindungen, polare Verbindungen | L43 | Altmann Reprosil Fluosil PFP |
Je nach Derivatisierungsgrad der freien Silanolgruppen weisen die HPLC-Säulen einer Art, wie z.B. C18, z.T. große Unterschiede in ihrer Hydrophobizität und somit auch in ihrer Selektivität auf. RP-Säulen können somit auch spezifisch, dem jeweiligen Trennproblem entsprechend, ausgewählt werden. Eine gute Auswahlhilfe bieten hier der HPLC-Säulenkonfigurator oder der Selectivity Chart von Waters.
Die Elution der Analyten erfolgt wie bei der NPC durch Einsatz eines ausreichend starken Fließmittels. In der RPC werden dazu polare Lösungsmittel, in denen die Analyten gut löslich sind, verwendet. Die Elutionskraft der mobilen Phase richtet sich bei der RPC jedoch, revers zur NPC, nach ihrer Hydrophobizität. Je apolarer die mobile Phase, desto schneller erfolgt die Elution der Analyten.
Die „elutrope Reihe“ ist bei der RPC in umgekehrter Reihenfolge gültig. Wasser hat hier die geringste Elutionskraft.
Neben den silica-basierten Materialien sind für die RPC auch HPLC-Säulen auf Polymer-Basis erhältlich. Diese bestehen z.B. aus Polystyrol-Divinylbenzol und weisen eine höhere pH-Stabilität auf (pH 1-13). Damit stellen sie eine interessante Alternative für die Analytik im stark Sauren bzw. Basischen dar, sind jedoch nicht so druckstabil wie die silica-basierten Materialien (je nach Material bis max. 350 bar).
Die RPC bietet den Vorteil, dass sie für ein breites Spektrum an Analysen eingesetzt werden kann. Dazu zählen neben der Analytik von polaren und apolaren Substanzen auch die von Analyten, die als Ionen vorliegen. Die Steuerung der Trennung erfolgt in diesem Fall über die entsprechende Auswahl der mobilen Phase.
Alternativ sind auch Reversed Phase-Materialien erhältlich, die zusätzlich zur hydrophoben Alkylkette auch hydrophile oder anionische und/oder kationische Liganden besitzen. Bei diesen erfolgt die Trennung ebenfalls über die Einstellung der mobilen Phase bezüglich pH-Wert, Salzkonzentration und Organikanteil.