HPLC-Säule.de – Wissenswertes rund um HPLC-Säulen

Troubleshooting in der HPLC-Anwendung

Trotz sorgfältigem Umgang mit stationärer und mobiler Phase sowie fachgerechter Wartung Ihrer HPLC-Anlage können immer wieder Probleme bei der HPLC-Analytik auftreten. Durch den modularen Aufbau einer HPLC-Anlage können diese viele Ursachen haben. Als erster Schritt sollte deshalb zuerst die mögliche Fehlerquelle eingegrenzt werden. Ist diese erst einmal gefunden, lassen sich die Probleme anschließend in vielen Fällen recht einfach und schnell beheben.

Treten die Probleme bei einer in Ihrem Labor etablierten Methode auf, sollten zuerst die chromatografischen Bedingungen überprüft werden. Hat sich etwas im Vergleich zur letzten fehlerfreien Sequenz geändert? Wurde die HPLC-Säule oder die mobile Phase ausgetauscht? Wenn Sie das Fließmittel selbst herstellen: Hat sich die Charge der Rohstoffe geändert? Hat sich die Probenmatrix oder etwas an der Probenvorbereitung geändert? Auch ein Blick auf das HPLC-Programm kann sich lohnen: wurden hier Parameter versehentlich geändert oder eine falsche Methode für die Sequenz ausgewählt?

Aufgrund der unterschiedlichen Detektionsarten in der HPLC-Analytik können Probleme, deren Ursache beim Detektor liegt, schwer verallgemeinernd zusammengefasst werden. Trotzdem empfiehlt es sich auch hier die Einstellungen des Detektors überprüfen: Gab es Veränderungen?

Bei neuen Methoden achten Sie auch auf die Konfiguration Ihres Detektors. Passt diese zu Ihrer geplanten Analytik? Entspricht z.B. das Volumen der Detektorzelle oder die Datenaufnahmerate den chromatografischen Bedingungen? Passt im umgekehrten Fall Ihre Analytik (z.B. Zusammensetzung der mobilen Phase) zu Ihrem Detektor? Auch die weiteren Module Ihres HPLC-Systems sollten passend zur neuen Methode konfiguriert sein. Dazu zählen z.B. die Größe der Dosierschleife sowie die Leistungsmerkmale der Pumpe.

Nachstehend haben wir die gängigsten Probleme nach ihrem Erscheinungsbild mit ihren Fehlerquellen und empfohlenen Maßnahmen zusammengestellt – für ein effizientes und erfolgreiches Troubleshooting.

Problem: Zu breite Peaks in der HPLC

Mögliche Ursache Maßnahme
Zu hohes Injektionsvolumen Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten)
HPLC-Säule überladen Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten) Probe verdünnen
Zu hohe Elutionskraft des Sample Solvents Sample Solvent der mobilen Phase anpassen: gleiche oder idealerweise geringere Elutionskraft (Fokussierung der Probe am Säulenkopf)
Schlechte Trennleistung Säulentemperatur erhöhen Flussrate reduzieren Säule mit kleinerer Partikelgröße verwenden
Zu großes Totvolumen des HPLC-Systems Verwendung von Kapillaren mit kleinerem Innendurchmesser Vermeidung unnötig langer Kapillarverbindungen Verwendung passender Fittings
Zu lange Retentionszeit Elutionskraft der mobilen Phase erhöhen Auf Gradientenelution wechseln
Überlagerung zweier Peaks Trennleistung der HPLC-Säule mit Standards überprüfen Auf Kontamination prüfen, gegebenenfalls Probenvorbereitung anpassen
Niedrigere Säulentemperatur Säulentemperatur und Funktion des Säulenofens überprüfen
Veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase Zusammensetzung und Reinheit des Fließmittels überprüfen, gegebenenfalls austauschen Funktion der Pumpe überprüfen, gegebenenfalls warten
Zu geringe Pufferkonzentration Auf ausreichende Pufferkonzentration achten
Kontamination des inline-Filters / der Vorsäule Inline-Filter / Vorsäule tauschen
Alterung der analytischen Säule Säule spülen Säule austauschen Inline-Filter oder vorzugsweise Vorsäule verwenden

Problem: Peak Fronting

Mögliche Ursache Maßnahme
HPLC-Säule überladen Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten) Probe verdünnen
Zu hohe Elutionskraft des Sample Solvents Sample Solvent der mobilen Phase anpassen: gleiche oder idealerweise geringere Elutionskraft (Fokussierung der Probe am Säulenkopf)

Problem: Peak Tailing

Mögliche Ursache Maßnahme
HPLC-Säule überladen Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten) Probe verdünnen
Zu hohe Elutionskraft des Sample Solvents Sample Solvent der mobilen Phase anpassen: gleiche oder idealerweise geringere Elutionskraft (Fokussierung der Probe am Säulenkopf)
Geänderter pH-Wert der mobilen Phase pH-Wert der mobilen Phase überprüfen (pH-Wert zu nahe am pKs-Wert des Analyten?), gegebenenfalls austauschen
Gleichzeitige Elution einer unbekannten interferierenden Substanz Probenvorbereitung anpassen Chromatografie anpassen
Kontamination des inline-Filters / der Vorsäule Inline-Filter / Vorsäule tauschen
Alterung der analytischen Säule Säule spülen Säule austauschen Inline-Filter oder vorzugsweise Vorsäule verwenden
Kontamination der mobilen Phase Fließmittel austauschen

Problem: Doppelpeaks

Mögliche Ursache Maßnahme
Zu hohes Injektionsvolumen Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten)
HPLC-Säule überladen Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten) Probe verdünnen
Zu hohe Elutionskraft des Sample Solvents Sample Solvent der mobilen Phase anpassen: gleiche oder idealerweise geringere Elutionskraft (Fokussierung der Probe am Säulenkopf)
Gleichzeitige Elution einer unbekannten interferierenden Substanz Probenvorbereitung anpassen Chromatografie anpassen
Gleichzeitige späte Elution einer unbekannten Substanz aus dem vorangegangenen Lauf Säule mit einem starken Eluenten nach jedem Lauf spülen (Blank-Injektion) Bei Gradientenelution: auf höhere Konzentration fahren Probenvorbereitung anpassen Mobile Phase auf Kontamination überprüfen und gegebenenfalls austauschen
Probe doppelt injiziert Funktion des Autosamplers überprüfen, gegebenenfalls warten
Kanalbildung in der HPLC-Säule Trennsäule tauschen
Kontamination des inline-Filters / der Vorsäule Inline-Filter / Vorsäule tauschen
Alterung der analytischen Säule Säule spülen Säule austauschen Inline-Filter oder vorzugsweise Vorsäule verwenden
Kontamination der mobilen Phase Fließmittel austauschen

Problem: Geisterpeaks

Mögliche Ursache Maßnahme
Elution einer unbekannten Substanz Probenvorbereitung anpassen
Kontamination der mobilen Phase Fließmittel austauschen

Problem: Spikes

Mögliche Ursache Maßnahme
Luft im System System spülen und mobile Phase entgasen Funktion des Degassers überprüfen
HPLC-Säule ausgetrocknet Säule tauschen

 

Tipps & Tricks rund um die Basislinie

Problem: Erhöhtes Grundrauschen

Mögliche Ursache Maßnahme
Schwankungen der Raumtemperatur Änderung der Raumtemperatur vermeiden Gegebenenfalls Säulenofen bei Raumtemperatur betreiben
Anreicherung von Verunreinigungen Probenvorbereitung anpassen Mobile Phase auf Kontamination überprüfen, gegebenenfalls austauschen

Problem: Drift der Basislinie

Mögliche Ursache Maßnahme
Anreicherung von Verunreinigungen Probenvorbereitung anpassen Mobile Phase auf Kontamination überprüfen, gegebenenfalls austauschen
Späte, langsame Elution einer unbekannten Substanz aus dem vorangegangenem Lauf Säule mit einem starken Eluenten nach jedem Lauf spülen (Blank-Injektion) Bei Gradientenelution: auf höhere Konzentration fahren ule mit einem starken Eluenten nach jedem Lauf spülen oder Gradienten mit einer höheren Konzentration beenden.

Tipps rund um die Retentionszeit

Problem: Verkürzte Retentionszeit

Mögliche Ursache Maßnahme
Ansteigende / erhöhte Flussrate Flussrate überprüfen, gegebenenfalls anpassen Pumpe überprüfen, gegenenenfalls warten
Veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase Zusammensetzung überprüfen, gegebenenfalls austauschen
Abbau der stationären Phase Trennsäule ersetzen Mobile Phasen / Proben auf Materialverträglichkeit laut Herstellerangaben prüfen

Problem: Verlängerte Retentionszeit

Mögliche Ursache Maßnahme
Reduzierte Flussrate Pumpe überprüfen, gegebenenfalls warten Suche nach Lecks (s. Leaks), diese beheben
Veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase Zusammensetzung überprüfen, gegebenenfalls austauschen Vorratsbehälter des Laufmittels verschlossen halten, um ein Abdampfen des Organikanteils zu verhindern
HPLC-Säule überladen. Injektionsvolumen reduzieren (Konfiguration des Autosamplers beachten) Probe verdünnen
Kontamination des inline-Filters / der Vorsäule Inline-Filter / Vorsäule tauschen
Alterung der analytischen Säule Säule spülen Säule austauschen Inline-Filter oder vorzugsweise Vorsäule verwenden

Problem: Schwankende Retentionszeit

Mögliche Ursache Maßnahme
Schwankende Säulentemperatur Bei Raumtemperatur: Sicherstellen, dass diese konstant ist, gegebenenfalls Säulenofen bei Raumtemperatur betreiben Bei Verwendung eines Säulenofens: Temperatur und Funktion überprüfen
Leaks Auf Leaks überprüfen, diese beheben (s. Leaks)
Interaktion der Probe mit dem Säulenmaterial (Retentionszeit bleibt bei späteren Injektionen gleich) Konditionieren der Trennsäule mit konzentrierter Probe vor Start der Sequenz
Unzureichende Pufferkapazität Ausreichende Pufferkonzentration verwenden
Unzureichende Mischung der mobilen Phase Funktion der Pumpe und des Mixer überprüfen, gegebenenfalls warten
Unzureichende Äquilibrierung Bei Gradientenelution: ausreichende Äquilibrierung auf die Anfangsbedingungen des Gradienten nach jedem Lauf
Luft im System System spülen und mobile Phase entgasen Funktion des Degassers überprüfen, gegebenenfalls warten

Tipps & Tricks rund um den Druck

Problem: Kein Druck, zu geringer Druck oder Druckverlust

Mögliche Ursache Maßnahme
Unterbrochener Fluss der mobilen Phase System auf Leaks (s. Leaks) untersuchen Vorrat an mobiler Phase überprüfen, gegebenenfalls auffüllen Fritten der mobilen Phasen auf Verunreinigungen überprüfen, gegebenenfalls tauschen Funktion der Pumpe überprüfen, gegebenenfalls warten
Abbau der stationären Phase Trennsäule austauschen Mobile Phasen / Proben auf Materialverträglichkeit laut Herstellerangaben prüfen
Veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase Zusammensetzung überprüfen, gegebenenfalls austauschen
Änderung der Säulentemperatur (höhere Temperatur) Säulentemperatur und Funktion des Säulenofens überprüfen
Änderung des Pumpenprogramms Programm überprüfen, gegebenenfalls anpassen

Problem: Druckschwankungen

Mögliche Ursache Maßnahme
Luft im System Mobile Phasen entgasen System spülen
Pumpe defekt Pumpe überprüfen, gegebenenfalls warten

Problem: Zu hoher Druck, Druckanstieg

Mögliche Ursache Maßnahme
Ablagerung von Feststoffen am Säulenkopf Bei Verwendung eines inline-Filters bzw. einer Vorsäule diese austauschen. HPLC-Säule spülen, gegebenenfalls entgegengesetzt der Flussrichtung Säule austauschen Probenvorbereitung bzgl. Aufreinigung anpassen Bei Verwendung von Pufferlösungen darauf achten, dass der Organikanteil nicht zu hoch ist bzw. wird, um ein Ausfallen der Salze zu verhindern Selbst hergestellte Pufferlösungen vor der Verwendung filtrieren Regelmäßiger Wechsel der mobilen Phasen, um mikrobielles Wachstum zu verhindern
Injektor oder Zuleitungen zugesetzt Bei laufender Pumpe ab dem Detektor sukzessive Verschraubungen Richtung Injektor lösen und Druck beobachten, bis die verstopfte Stelle gefunden ist. Diese reinigen oder gegebenenfalls austauschen
Bei Verwendung von Polymer-Phasen: Material aufgequollen Säule austauschen Mobile Phasen / Proben auf Materialverträglichkeit laut Herstellerangaben prüfen
Veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase Zusammensetzung der mobilen Phase überprüfen, gegebenenfalls austauschen
Änderung der Säulentemperatur (niedrigere Temperatur) Säulentemperatur und Funktion des Säulenofens überprüfen

Wenn Leaks auftreten

Mögliche Ursache Maßnahme
Zu hoher Druck System auf Verstopfungen überprüfen (s. Zu hoher Druck)
Pumpe undicht Pumpe überprüfen, gegebenenfalls warten
Injektor undicht Injektor überprüfen, gegebenenfalls warten
Sechswegeventil undicht Sechswegeventil überprüfen, gegebenenfalls warten / austauschen
Fittings lose / nicht passend Fittings überprüfen, gegebenenfalls nachziehen bzw. tauschen

Weitere nützliche Informationen zum Troubleshooting in der HPLC gibt es (auf englisch) hier: www.usp.org/app/USPNF/columns.html