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Lösemittel für die HPLC

Auswahl des richtigen Lösemittels für die HPLC

Es wird immer wieder betont, wie wichtig es ist, in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) hochreine Lösungsmittel (auch bekannt als Lösemittel oder Laufmittel) als mobile Phase einzusetzen. Dazu stehen dem Anwender unterschiedliche Reinheitsgrade zur Verfügung, wie z. B. HPLC grade, Gradient grade oder LC-MS grade.

Doch worin liegt für die Chromatographie der Unterschied zwischen den verschiedenen Qualitäten und zu Lösungsmitteln p.a., die ebenfalls eine hohe Reinheit aufweisen? Und wieso ist es sinnvoll, ein Lösungsmittel mit einer Qualität gemäß der durchzuführenden Applikation einzusetzen?

Allen Qualitäten eines Lösungsmittels ist gemein, dass sie von dem gleichen Rohstoff abstammen und nominell eine hohe Reinheit mit nur geringen Spuren an Fremdsubstanzen aufweisen (99.8 – 99.9 %, je nach Produkt). Doch genau diese minimalen Rückstände können in der Chromatographie je nach Detektionsart durchaus Probleme bereiten, so dass in diesem Fall „rein“ nicht mit „rein“ gleichzusetzen ist.

Im Folgenden werden die Unterschiede zwischen den drei Kategorien an Lösungsmittel-Qualitäten und der Sinn der Verwendung einer entsprechenden Qualität dargestellt.

HPLC grade

HPLC grade beschreibt die Qualität von Lösungsmitteln, die v.a. für die isokratische Trennung unter Anwendung von UV- oder Fluoreszenzdetektoren konzipiert sind. Diese Lösungsmittel zeichnen sich durch eine hohe Reinheit mit hoher UV-Durchlässigkeit bei allen relevanten Wellenlängen, niedriger Eigenfluoreszenz sowie geringem Abdampfrückstand und geringer Acidität und Alkalität aus.

Die Lösungsmittel werden speziellen Reinigungsschritten unterzogen, um mögliche interferierende Substanzen zu entfernen. Dadurch werden Störpeaks durch Verunreinigungen minimiert und ein geringes chromatographisches Grundrauschen ermöglicht.

Nach ihrer Reinigung werden sie spezifisch auf ihre Eignung für die UV- und Fluoreszenz-Detektion in der HPLC getestet. Durch die Qualitätskontrolle ist gewährleistet, dass Sie immer die gleiche Qualität an Lösungsmittel erhalten und die Reproduzierbarkeit Ihrer HPLC-Analytik sichergestellt ist.

Gradient grade

Für die chromatographische Trennung von Substanzen wird in der HPLC neben der isokratischen häufig auch die Gradientenelution eingesetzt. Bei dieser verändert sich innerhalb eines Laufes die Zusammensetzung der mobilen Phase, so nimmt z. B. im Falle der Reversed Phase-Chromatographie der Organik-Anteil zu. Dies kann bei Lösungsmitteln, die nicht speziell für die Gradiententrennung hergestellt wurden, zu einem teils deutlichen Anstieg der Basislinie bei der UV-Detektion führen und die Sensitivität der Methode empfindlich beeinträchtigen.

Für eine optimale Chromatographie auch unter den Bedingungen eines Gradienten werden daher Gradient grade Lösungsmittel weiter aufgereinigt.

Neben ihrer Eignung für die UV- und Fluoreszenzdetektion werden sie auch spezifisch auf ihre Eignung für die Gradiententrennung hin überprüft, so dass auch bei Gradient grade Lösungsmitteln eine chargenkonsistente Qualität gewährleistet ist.

Die folgende Abbildung veranschaulicht an einem Gradientenprofil, welche guten Ergebnisse mit Acetonitril Gradient grade erzielt werden können. Es ist nur eine geringe Drift der Basislinie zu verzeichnen[I1] .

Gradientenprofil HPLC Lösemittel

LC-MS grade

Mit dem Einzug der (Ultra-)Hochdruckflüssigkeitschromatographie (U)HPLC-Massenspektrometrie (MS) in die Labore ergaben sich aufgrund der hohen Nachweisempfindlichkeit und der Art der Analyse neue Anforderungen an die verwendeten Lösungsmittel.

So ist das Augenmerk bei der Anwendung in der Massenspektrometrie vor allem auf eine hohe Ionisationseffizienz bei gleichzeitig geringem Ionenhintergrund gerichtet. Dazu werden die Lösungsmittel entsprechend aufgereinigt. Wichtig hierbei sind vor allem die Entfernung von Spurenelementen, organischen Stoffen und (Metall-)Ionen. Diese können zu einem erhöhten Grundrauschen und einer Adduktbildung mit den zu analysierenden Substanzen führen, was die Nachweisempfindlichkeit deutlich herabsetzen kann.

Zur Qualitätskontrolle werden die Lösungsmittel gegen Reserpin (m/z 609.49) als Standard getestet. Die folgende Abbildung zeigt exemplarisch den Scan im positiven und negativen ESI bzw. APCI-Modus. Über den getesteten Massenbereich ist ein nur geringes Grundrauschen sowie keine durch Verunreinigungen verursachten Signale zu verzeichnen[I2] .

LC MS Lösemittel

LC MS Lösemittel

LC-MS grade Lösungsmittel sind aufgrund ihrer sehr hohen Reinheit zudem auch besonders für die Anwendung in der UHPLC geeignet. Sie garantieren eine lange Lebensdauer der UHPLC-Säulen. Deshalb werden sie zusätzlich auch auf ihre Eignung für die UV- und Fluoreszenz-Detektion überprüft.

Fazit:

Die unterschiedlichen Qualitäten an Lösungsmitteln haben also, wie oben gezeigt, durchaus ihre Daseinsberechtigung. Neben den drei großen Gruppen HPLC grade, Gradient grade und LC-MS grade gibt es von einigen Herstellern auch Subkategorien, die eine Zwischenstellung zwischen z.B. Gradient grade und LC-MS grade einnehmen.

Das Verwenden von Lösungsmitteln geringeren Reinheitsgrades ist zwar möglich, birgt aber ein Risiko: Aufgrund nicht vorgesehener Qualitätskontrollen seitens der Hersteller bezüglich der höheren Reinheitsanforderungen ist die Richtigkeit und Reproduzierbarkeit der Analytik nicht konstant sichergestellt. Mit jeder neuen Charge muss mit Überraschungen wie einem erhöhten Grundrauschen oder Störpeaks durch Verunreinigungen gerechnet werden.

Der Einsatz von Lösungsmitteln einer der durchzuführenden Analytik angemessenen Qualität ist aus diesen Gründen also sinnvoll und auch zu empfehlen. Nur so ist eine chargenunabhängige Chromatographie, mit der Sie exakte und reproduzierbare Ergebnisse erhalten, gewährleistet.


 [I1]Merck Solvent Catalogue S.12

 [I2]Merck Solvent Catalogue S.14

 

Anmerkung der Redaktion: Bei diesen Hinweisen und Tipps handelt es sich um Empfehlungen von Anwendern aus Laboren. Wenn Sie weitere Tipps & Tricks haben oder eigene Probleme darstellen möchten, schreiben Sie uns gerne eine Mail an info@hplc-saeule.de.

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